4℃避光保存1个月内有效。

　　1. 乳腺癌类器官培养

（1）消化后的细胞悬液进行计数。

（2）按每孔1~2×10⁴个细胞密度计算所需细胞数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5 mL离心管中，离心，弃上清，将细胞沉淀置于冰上。

（3）按1：2体积比，将一份体积的含1%BSA的DMEM加入2份体积的细胞外基质胶（Corning#356231）中，轻轻混匀（全程冰上操作），然后在冰上将配好的基质胶混合液与细胞沉淀充分混匀。

（4）将细胞沉淀与基质胶的混合液按照35 μL/孔滴在已提前预热好的24孔板中央，使之形成圆顶状胶滴。缓慢将细胞培养板移至培养箱至少30 min。

（5）待基质胶完全凝固，沿24孔壁缓慢加入1 mL/孔预先恢复至室温的本类器官培养基，并将培养板置于37℃，5%CO₂条件下静置培养。

（6）镜下观察类器官形成情况，每3~4天更换一次培养基。

　　2. 乳腺癌类器官的收集

（1）弃培养基，每孔加入1 mL预冷的无血清DMEM:F12培养基并用该培养基润洗枪头，反复吹打至圆顶状胶滴完全脱离板底，将孔内吹散后的类器官混合液收集至15 mL离心管中。重复操作一次。将两次洗脱下来的类器官混合液合并收集至同一离心管中，1500 rpm离心5 min，轻轻吸去上清和基质胶层，沉淀待用。

（2）沉淀加入3-5 mL类器官解离试剂（PRS-ODR），37℃，200 rpm水平摇床上解离10 min（具体解离时间根据类器官大小和数量决定，以肉眼可见颗粒明显减小一半为准，可中途取解离的类器官显微镜下观察，类器官解离至平均包含有5~10个细胞的细胞团块大小最佳）。

（3）解离结束后加入和解离试剂等体积的含10%FBS的DMEM稀释。1500 rpm离心3 min，弃上清，待用。

　　3. 乳腺癌类器官传代

（1）收集好的细胞沉淀（以无肉眼可见基质胶状沉淀为准）加入1~2 mL预冷的含1%BSA的DMEM培养基重悬，在4℃下，1500 rpm，离心5 min。

（2）小心吸弃上清，沉淀用乳腺癌类器官培养基重悬计数。

（3）按照步骤3（2）~（6）的操作，以大约1000个类器官/孔密度重新接种类器官，并继续扩大培养。